Extracción de helmintos adultos
En estado adulto, los helmintos se encuentran parasitando principalmente el aparato digestivo y glándulas anexas de sus huéspedes, aunque también los podemos localizar en branquias, pulmones, piel y aletas, riñones, sangre, vejigas natatoria y urinaria y cavidad del cuerpo. Las formas larvarias pueden encontrarse enquistadas o libres, en prácticamente todos los órganos (Roberts y Janovy, 2005). Para la extracción de este grupo de parásitos, el vertebrado deberá ser sacrificado aplicando alguna de las diversas técnicas existentes, como la decapitación, la asfixia manual, descerebrado mediante golpe, etc., sin embargo se recomienda la sobredosis de anestesia aplicada intraperitonealmente o la descerebración, por considerar que son las más humanitarias para el animal. La técnica de necropsia debe efectuarse de manera inmediata a la muerte del huésped para evitar que sus tejidos y los de los helmintos se lisen; esta técnica incluye la revisión cuidadosa de las cavidades bucal, nasal y auditiva.
Parte 1. Adultos asociados a órganos
1. Antes de iniciar la disección es importante la revisión exhaustiva en busca de artrópodos asociados.
2. Realizar la disección de los huéspedes con ayuda de tijeras o bisturí, practicando una incisión ventral desde al ano hasta la boca; una vez abierta la cavidad y expuestos los órganos,separar éstos individualmente en cajas de petri con solución salina fisiológica (SSF) de cloruro de sodio (0.65% para organismos ectodérmicos y 0.85% para endotérmicas), en una proporción adecuada al tamaño del órgano.
3. La cavidad abdominal del animal deberá ser revisada bajo el microscopio estereoscópico en busca de helmintos. Abrir los órganos huecos (estómago, intestino, etc) longitudinalmente con tijeras para iris; los sólidos, como corazón, músculos, hígado, cerebro, bazo y riñones, comprimirlos entre dos placas de vidrio grueso, separando los gusanos con pinceles finos para evitar su maltrato por manejo y colocándolos en cajas de petri con la SSF correspondiente.
4.- Una alternativa para recuperar todo el material helmintológico es someter a los órganos y tejidos a una digestión artificial, transfiriéndolos a frascos de vidrio con tapa de rosca.
5.- Una vez recuperados los helmintos, fijarlos de acuerdo con el grupo taxonómico al que pertenezcan y el tipo de estudio al que se someterán: para analizarlos con microscopía electrónica, fijar el material en glutaraldehido al 2%, formol al 14% o AFA (agua- alcohol- formol- ácido acético)
6.- Para su estudio molecular, fijarlos en alcohol al 96%. Si el material se destinará para estudios morfológicos, aplicar el siguiente método dependiendo de cada helminto identificado.
a) Platelmintos: Fijarlos en formol (formalina) a14% caliente (menos de 75ºC) para que mueran extendidos, agregando el líquido directamente en la caja de petri, la cual deberá contener la menor cantidad posible de SSF; posteriormente, transferirlos a viales con alcohol al 70%. En el caso de infecciones masivas por monogéneos, fijar las branquias directamente en formol al 4% caliente y posteriormente revisar este líquido bajo el microscopio. Para la identificación de los cestodos es indispensable colectar el escólex y segmentos con distintos grados de maduración; asimismo, su cuantificación se realiza con base en el número de escólices encontrado. Para el estudio de las estructuras esclerosadas de monogéneos y cestodos (ganchos, órgano copulador), véase García-Vásquez et al. (2010).
b) Acantocéfalos: Colocar los ejemplares recolectados vivos en viales con agua destilada a una temperatura de 8 "C durante 24 horas, con el propósito de que viertan la proboscis; posteriormente, fijarlos en formol al 4% caliente y transferirlos a alcohol al 70%, donde se conservan hasta su procesamiento.
c) Nematodos: Colectar y fijar en formol a14%, o alcohol al 70% caliente, con el propósito de que el cuerpo del gusano se distienda lo más posible, conservándose en viales con este mismo líquido.
Parte 2. Sanguijuelas asociadas
1. En el caso de los hirudíneos deberán desprenderse directamente de la superficie del cuerpo de sus huéspedes; en el caso de ejemplares fuertemente adheridos pueden aplicarse unas gotas de alcohol en la zona de contacto, o bien, refrigerar al huésped durante 30 minutos.
2.- Una vez desprendidas, las sanguijuelas deben mantenerse en el agua del medio hasta su fijación.
3. Antes de fijarse, distender a las sanguijuelas mediante hipotermia a 5ºC durante una hora, o bien, agregar gotas de alcohol al 70% o agua mineral, así como nicotina (tabaco cigarro o puro) y cristales de fenal, directamente en el agua del medio donde se mantiene, realizar esta acción hasta que dejen de moverse.
4.- Fijar en formol a 14% y conservar en alcohol al 70%.
